MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO
SECRETARIA DE DEFESA AGROPECUARIA
PORTARIA Nº. 64, DE 18 DE MARÇO DE 1994
(REVOGADA PELA INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 28, DE 21 DE JULHO DE 2017)
O Secretário de Defesa Agropecuária, Substituto, usando da atribuição que lheconfere o artigo 78, item VII, do Regimento Interno da Secretaria, aprovado pela PortariaMinisterial n. 212, de 21 de agosto de 1992, resolve:
Art. 1º Aprovar as Instruções anexas a esta Portaria, que versam sobre Normas deProdução, Controle e Emprego de Tuberculina.
Art. 2º Esta Portaria entra em vigor na data de sua publicação.
Marcus da Costa Ferreira
Secretário, substituto.
ANEXO
NORMAS PARA PRODUÇÃO E CONTROLE DE TUBERCULINA PPD
1.- Definição:
Tuberculina PPD ("Purified Protein Derivative") é o extrato protéico,obtido pela precipitação de proteínas produzidas por micobactérias cultivadas em meiosintético, isento de restos de meios de cultura e proteínas estranhas, diluída naconcentração adequada para seu uso.
2.- Da Produção:
2.1.- O laboratório deverá atender integralmente a disposição da legislaçãovigente no que se refere a produção de produtos biológicos, principalmente quanto a segurança biológica.
2.2.- Responsabilidade Técnica A produção deste reagente deverá estar sob aresponsabilidade técnica de profissionais especializados, credenciados pelo órgãocompetente do Ministério da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma Agrária, medianteapresentação de documentos que permitam julgar sua especialização. O responsável ouseu substituto deverá participar de todas as etapas de produção e controle do reagente.
2.3.- Controle de Produção
Todas as fases de produção e controle serão registradas em protocolos apropriadosque deverão acompanhar o produto por ocasião da colheita e remessa ao laboratório decontrole oficial. O Serviço de Sanidade Animal da Diretoria Federal de Agricultura, doAbastecimento e da Reforma Agrária da Unidade Federativa sob sua jurisdição serácomunicado com antecedência mínima de 10 dias a disponibilidade do reagente paracolheita fiscal.
2.4.- Amostras
As amostras reconhecidas para produção de tuberculina PPD serão as seguintes:
- PPD bovina - "Mycobacterium bovis" amostra ANs'
- PPD aviária - "Mycobacterium avium" amostra Doi'
2.4.1.- Manutenção de Amostras
As amostras serão conservadas de preferência sob a forma liofilizada, sendo,entretanto aceita a conservação sob congelamento a -20°C em meio de "Lowenstein -Jensen", com repiques anuais.
2.4.2.- Produção de Películas
As películas de micobactérias para semeadura serão produzidas inicialmente em ágar"Middlebrook 7H1o", sendo posteriormente multiplicado em meio de"Dorset-Henley" (Anexo I).
2.5.- Inoculação de Películas
As películas serão inoculadas em frascos, adequados para produção, contendo meiosintético de "Dorset-Henley".
2.6.- Período de Incubação
Os frascos de cultura serão incubados a 37°C, até a fase de submersão das culturasque deverá ocorrer entre 8 a 10 semanas.
As culturas que submergem prematuramente e as contaminadas deverão ser descartadas.
2.7.- Inativação de Culturas Terminado o período de incubação, as culturas serãoinativadas em vapor fluente (100°C), durante três horas. Aquelas que se mostrarem turvasserão descartadas.
2.8.- Separação da Massa Bacteriana
Após o resfriamento, o conteúdo dos frascos será filtrado através de papel xaropeou em camada de gaze e algodão, em seguida através de membrana clarificante.
2.9.- Precipitação de Proteínas
Será realizada pela adição de ácido tricloro-acético a 400/0, de tal forma que ovolume final tenha uma concentração de 4%. O processo de precipitação, purificação edissolução de proteínas deverá ser realizado no mesmo dia. 2.10.- Purificação deProteínas
O precipitado protéico será submetido a duas lavagens com ácido tricloroacético a1%, seguidas de duas lavagens com fosfato de potássio monobásico a 0,3%.
Ajustar o pH para 2,7 quando necessário pela adição de ácido tricloro-acético a1%.
2.11.- Dissolução de Proteínas
O produto das lavagens será diluído em solução de fosfato de sódio bibásico M/15pH 9.0. A cada parte da solução protéica concentrada (entre 6 a 15mg/ml), seráadicionado 1/4 em volume de solução antibacteriana (Anexo 11) e o pH ajustado para 7.0.
2.12 - Centrifugação do Concentrado
A solução protéica concentrada será centrifugada a 2.000g durante 20 minutos pararemover material de alto peso molecular e detritos celulares.
2.13 - Determinação da Concentração Protéica Será realizada pelo método de"Kjeldahl" ou método de biureto.
2.14 - Validade e Conservação do Concentrado
O concentrado terá uma validade de 2 anos, a partir da determinação daconcentração protéica, devendo ser conservado em geladeira entre 2° a 8°C, sob oabrigo da luz.
2.15 - Controle de Potência Biológica Retirar uma alíquota da solução protéicaconcentrada suficiente para realizar o controle de potência biológica em cobaias,diluindo a 1mg/ml para tuberculina bovina. Em se tratando de tuberculina aviária, adiluição será de 0,5mg/ml.
2.16 - Diluição de Proteínas
O concentrado de tuberculina PPD será diluído em diluente de tuberculinas PPD (AnexoIII).
2.17 - Adição de Corantes
A tuberculina PPD aviária será adicionada de um volume do corante "Ponceau 2 R a2% em 400 volumes do produto.
A concentração final do cor ante será de 0,005%. 2.18 - Filtragem
Após a diluição de cada partida, as mesmas serão submetidas à filtragemesterilizante e em seguida à prova de esterilidade (item 3.2).
2.19 - Envasamento
Em frascos ou carpule de vidro neutro e o produto deverá ocupar completamente o frascoou carpule.
2.20-Conservação
A tuberculina PPD deverá ser conservada a temperatura entre 2°C e 8°C, sob abrigo daluz.
2.21 - Validade
Um ano após a data de fabricação.
2.22 - Apresentação
A tuberculina PPD bovina apresenta-se sob a forma líquida incolor e a PPD aviária soba forma líquida com coloração vermelho claro.
3 - Do Controle:
3.1 - Colheita da Amostra
A colheita deverá ser efetuada de acordo com a Instrução Normativa DDA nº 1,atendendo ainda aos seguintes itens:
3.1.1 - Qualquer partida de tuberculina produzida e apresentada ao controle oficialpara fins de comercialização não deverá ter volume inferior em número de doses a 50%de seu lote comercial.
3.1.2 - Quando for enviada ao controle oficial 2 (duas) ou mais partidas de um mesmolaboratório em um só teste, cada uma destas, não deverá ter número de doses inferiora 70% do lote comercial da indústria em questão.
3.2 - Esterilidade
O produto deverá estar livre de germes viáveis ou produtos estranhos que não sejamtubérculo proteínas. Serão utilizados cinco frascos da mesma partida de tuberculinapara realização do teste de esterilidade.
3.2.1 - Pesquisa de Fungos e Leveduras Inocular 1,0ml de cada frasco de tuberculina PPDem um frasco contendo não menos que 80ml de caldo "sabouraud" e incubar atemperatura entre 20- 25°C durante 14 dias.
3.2.2 - Pesquisa de Bactérias Aeróbicas
Inocular 1,0ml de cada frasco de tuberculina PPD em um frasco contendo não menos que80ml de caldo "triptcase soya" e incubar a 37°C durante 14 dias.
3.2.3 - Pesquisa de Bactérias Anaeróbicas
Inocular 1,0ml de cada frasco de tuberculina PPD em um frasco contendo não menos que80ml de caldo tioglicolato e incubar a 37°C durante 14 dias.
3.3 - Determinação de Fenol
A concentração de fenol deverá ser de 0,5%. De acordo com o teste de "Folin eCiocalteau".
3.4 - Inocuidade
Duas cobaias saudáveis que não receberam tratamento sensibilizante, pesando entre 250a 400 gramas, são inoculadas com 1,0ml de tuberculina por via subcutânea e observadaspor 10 dias. A tuberculina será considerada inócua se não for observada nenhumareação adversa ou morte do animal.
3.5 - Pesquisa de Bacilos Álcool - Acido Resistentes e Outras
Impurezas.
Uma amostra de 20ml de tuberculina será submetida a centrifugação a 1.000g por 15minutos e o sedimento corado pelo método de "gram e Ziehl-Neelsen". Nenhumbacilo álcool-ácido resistente ou resíduos celulares ou de outras bactérias deverãoser encontrados.
3.6 - Controle de Potência Biológica
A potência biológica de cada partida de tuberculina PPD deverá ser determinada emcomparação com a tuberculina PPD de referência correspondente, em termos de potênciarelativa.
3.6.1 - Diluição de Tuberculina para Determinação da Potência
Biológica - A tuberculina será diluída em salina isotônica tamponada (Anexo
IV) nas seguintes diluições:
- PPD bovina - 1:200, 1:1000 e 1:5000;
- PPD aviária - 1:100, 1:500 e 1:2500.
3.7 - Prova de Potência em Cobaias Sensibilizadas
A prova será realizada no mínimo em 6 (seis) cobaias albinas, pesando entre 400 a600g, previamente sensibilizadas (Anexo V) e com os flancos depilados. Tanto a tuberculinade referência como a sob controle serão inoculadas na dose de 0,2ml de cada diluiçãopor via intradérmica aleatoriamente. A leitura das reações será realizada após 24horas pela medida do diâmetro do eritema.
3.8 - Análise Estatística.**
Realizada de acordo com o Centro Panamericano de Zoonosis, 1980.*
A atividade relativa da tuberculina sob teste em relação a tuberculina de referênciadeverá estar entre 100 j; 20%, com limites de confiança (p = 0,95%), entre 75 a 130%("World Health, Organization", 1968).
4 - Disposições Gerais
4.1 - Somente poderão ser utilizadas tuberculinas previamente submetidas ao processode controle efetuado pelos laboratórios do Ministério da Agricultura, do Abastecimento eda Reforma Agrária ou por ele credenciado.
4.2 - Os critérios estabelecidos nesta Norma, serão passíveis de alterações àmedida que a experiência adquirida assim o indicar e serão efetuadas mediante discussãoprévia com os laboratórios produtores.
* Centro Panamericano de Zoonosis"
Tuberculosis. "Preparación y Estandarización de Tuberculinas PPD". NotaTécnica nº 17, de Rev. I, OPAS, 1980.
** Organización Mundial de la Salud Comité de Exportos de la OMS em PatronesBiológicos. Vigesimo Inform.
Serie de Informes Tecnicos nº 384, de 1968, 104 p.
NEXO I
MEIO SINTÉTICO DE DORSET & HENLEY
1. SOLUÇÃO DE MICROELEMENTOS
Sulfato de zinco. 7H2O.............................................................................. 200mg
Cloreto de manganês 4H2O......................................................................... 50 mg
Cloreto de Cobalto 6H2O............................................................................. 70mg
Água bidestilada........................................................................................500ml
Esterilizar três dias consecutivos em vapor fluente durante 30 minutos.
2. COMPOSIÇÃO DO MEIO
L.asparagina ................................................ 112,0g em 2.000ml deágua destilada
Citrato de sódio 2H2O ........................................ 7,2g em 1.000ml deágua destilada
Fosfato dipotássico ............................................ 11,0g em 900ml deágua destilada
Sulfato de magnésio ................................ 7H2O 12,0g em 1.000ml de águadestilada
Glicerina bidestilada................................................................................ 635,2ml
Glicose .......................................................... 80,0g em 2.000ml deágua destilada
Citrato de ferro 5H2O ......................................... 3,28g em 900ml de águadestilada
Observação: Quantidade total de água: 7.800 ml. A água deverá estar a 70ºC, comexcessão da água para dissolver o citrato de ferro que deverá ser levado a ebulição.
Misturar os ingredientes acima na seguinte seqüência:
1º) Asparagina
2º) Citrato de sódio
3º) Fosfato de potássio
4º) Sulfato de magnésio
5º) Citrato de ferro
6º) Glicerina
7º) Glicose
8º) Microelementos................................................................................. 200ml /
Ajustar o pH entre 6,8 e 7,1 com carbonato de sódio a 10% ou Ácido acético a 10%.Filtrar em membranas esterilizantes e envasar. Para prova de esterilidade do meio, deixara 37ºC por 48 horas e a (20-25ºC) por 20 (vinte) dias.
ANEXO II
SOLUÇÃO ANTIBACTERIANA
1. SOLUÇÃO M/15
SOLUÇÃO A
Fosfato monopotássico............................................................................... 9,07g
Água bidestilada..................................................................................... 2000ml
SOLUÇÃO B
Fosfato dissódico.......................................................................................9,46g
Água bidestilada..................................................................................... 2000ml
SOLUÇÃO FINAL
Solução A..............................................................................................389,0ml
Solução B..............................................................................................611,0ml
Total.....................................................................................................1000 ml
2. SOLUÇÃO ANTIBACTERIANA
Glicerina................................................................................................300,0ml
Cloreto de sódio.........................................................................................25,0g
Fenol........................................................................................................15,0g
Solução M/15 tampão Ph 7,0.................................................................... 300,0ml
Obs: Esta solução não é autoclavada.
ANEXO III
DILUENTE DE TUBERCULINA PPD
Solução tampão M/15 pH 7,0.................................................................... 5000ml
Glicerina..................................................................................................500ml
Cloreto de sódio.........................................................................................25,0g
Fenol........................................................................................................25,0g
Ajustar o pH 7,0
Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. ANEXO IV
SOLUÇÃO SALINA ISOTANICA TAMPONADA
Fosfato monopotássico............................................................................... 1,45g
Fosfato dissódico 2H2O............................................................................... 7,60g
Cloreto de sódio.........................................................................................4,80g
Água bidestilada qsp................................................................................ 1000ml
Autoclavar a 121°C durante 30 minutos. ANEXO V
SENSIBILIZAÇÃO DE COBAIAS
As cobaias devem ser sensibilizadas no mínimo 3 semanas antes de se efetuar as provasde avaliação biológica. Para os testes de PPD bovino emprega-se Mycobacterium bovisamostra AN5 a para testas de PPD aviária Mycobacterium avium amostra D4.
Para preparar o inóculo, coloca-se 100mg de massa úmida de micobactérias em um grale adiciona-se 100mg de pedra pomes em pó, moendo cuidadosamente. Acrescentar algumasgotas de parafina líquida contida na quantidade de 25 ml por frasco, moer novamente.Acrescentar o restante da parafina e homogeneizar. Colocar em um frasco Erlenmeyer einativar em vapor fluente durante 30 minutos. Esta suspensão contém 4,0 mg demicobactérias por ml. Injetar 0,5ml (2mg/ml) por via intramuscular ou intraperitonial emcada cobaia.
D.O.U., 23/03/1994